Kristallstrukturanalyse und Entwicklung von Computermodellen zur Beschreibung der Selektivität von Enzymen am Beispiel der Carboanhydrase

Ein Ziel der modernen Wirkstoffforschung ist die Entwicklung von Arzneistoffen, die selektiv mit einem Zielprotein wechselwirken. Dadurch sollen Nebenwirkungen in einem frühen Stadium der Entwicklung minimiert, wenn möglich sogar ausgeschlossen werden. Bei der strukturbasierten Entwicklung von Wirkstoffen wurden im Falle der Carboanhydrase (CA) die physikochemischen Eigenschaften von CA-Inhibitoren mit den biologischen Affinitäten an drei Isoenzymen (CA I, CA II, CA IV) korreliert. Mit den daraus erhaltenen 3D-QSAR-Modellen können diejenigen physikochemischen und strukturellen Eigenschaften der Verbindungen bestimmt werden, die die biologische Aktivität im Hinblick auf ein Isoenzym beeinflussen. Mit zwei verschiedenen Ansätzen wurden selektive 3D-QSAR-Modelle erhalten, mit deren Hilfe anhand von Konturdiagrammen Bereiche ermittelt werden können, die für eine bestimmte physikochemische Eigenschaft (sterische, elektrostatische, hydrophobe, Akzeptor, Donor) die Selektivität hinsichtlich eines Isoenzyms erhöhen oder erniedrigen. Aus dieser reinen Liganden-basierten Analyse konnten dennoch Rückschlüsse auf die Gegebenheiten in der umgebenden Bindetasche gezogen werden. Aber nicht nur die Auswertung von Ligandeninformationen kann wichtige Hinweise für die Entwicklung selektiver CA-Inhibitoren liefern. Die Auswertungen von Kristallstrukturen der CA bestätigten diese aus reiner Ligandeninformation erhaltenen Selektivitätsmodelle und lieferten zusätzliche Informationen für die Entwicklung selektiver Verbindungen. Ferner konnte anhand eines Homologiemodells der C AIX gezeigt werden, dass die Modellierung von Enzymen, deren Kristallstrukturaufklärung sich als schwierig erweist, durchaus nützliche Hinweise für den strukturbasierten Entwurf bzw. die Optimierung von Liganden liefern kann. Um potentielle neue (selektive) Leitstrukturen zu finden, können neben dem experimentellen Hochdurchsatz-Screening virtuell am Computer Datenbanken mit gespeicherten Molekülbibliotheken durchmustert werden. Die korrekte Vorhersage des Bindungsmodus und die korrekte Abschätzung der Bindungsaffinität der platzierten Moleküle ist entscheidend für die erfolgreiche Identifizierung von neuen Leitstrukturen. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass für CA-Inhibitoren mit einem rigiden Ringgerüst und mit bekannter Kristallstruktur der Bindungsmodus korrekt vorhergesagt werden konnte. In den Fällen, in denen die Bewertungsfunktionen der Dockingprogramme in der Affiniätsvorhersage der Verbindungen fehlschlagen, konnte durch die Kombination mit den zuvor erhaltenen 3D-QSAR-Modellen die Affinität dieser gedockten Verbindungen richtig abgeschätzt werden. Darüber hinaus wurde in Datenbanken und in der Literatur nach potentiellen neuen CA-Inhibitoren gesucht und ihre Bindung ließ sich biochemisch in einem Assay bestätigen. Eine Platzierung in der Bindetasche von CA II ermöglicht die korrekte Abschätzung der Affinität. Bei der Optimierung von Leitstrukturen/Wirkstoffen ist es sehr schwierig Wechselwirkungen mit Proteinen vorherzusagen beziehungsweise abzuschätzen, die sich in ihrer Sequenz und Funktion stark von dem Ausgangsprotein unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass Cyclooxygenase (COX)-2-selektiven Verbindungen (Valdecoxib, Celecoxib) ebenfalls CA hemmen. Obwohl beide Enzyme ? COX und CA - unterschiedliche biologische Funktionen besitzen, weisen beide Enzyme lokale Bereiche im aktiven Zentrum mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften auf, so dass die Bindung von Celecoxib und Valdecoxib an beiden Enzymen ermöglicht wird. Diese Kreuzreaktivität von Celecoxib und Valdecoxib wurden durch kinetische Daten und mit der Kristallstruktur von Celecoxib im Komplex mit CA II belegt

Concepts to Interfere with Protein-Protein Complex Formations: Data Analysis, Structural Evidence and Strategies for Finding Small Molecule Modulators

(1) Analyzing protein-protein interactions at the atomic level is critical for our understanding of the principles governing the interactions involved in protein-protein recognition. For this purpose descriptors explaining the nature of different protein-protein complexes are desirable. In this work, we introduce Epic Protein Interface Classification (EPIC) as a framework handling the preparation, processing, and analysis of protein-protein complexes for classification with machine learning algorithms. We applied four different machine learning algorithms: Support Vector Machines (SVM), C4.5 Decision Trees, K Nearest Neighbors (KNN), and Naïve Bayes (NB) algorithm in combination with three feature selection methods, Filter (Relief F), Wrapper, and Genetic Algorithms (GA) to extract discriminating features from the protein-protein complexes. To compare protein-protein complexes to each other, we represented the physicochemical characteristics of their interfaces in four different ways, using two different atomic contact vectors (ACVs), DrugScore pair potential vectors (DPV) and SFCscore descriptor vectors (SDV). We classified two different datasets: (A) 172 protein-protein complexes comprising 96 monomers, forming contacts enforced by the crystallographic packing environment (crystal contacts), and 76 biologically functional homodimer complexes; (B) 345 protein-protein complexes containing 147 permanent complexes and 198 transient complexes. We were able to classify up to 94.8% of the packing enforced/functional and up to 93.6% of the permanent/transient complexes correctly. Furthermore, we were able to extract relevant features from the different protein-protein complexes and introduce an approach for scoring the importance of the extracted features. (2) Since protein-protein interactions play pivotal role in the communication on the molecular level in virtually every biological system and process, the search and design for modulators of such interactions is of utmost interest. In recent years many inhibitors for specific protein-protein interactions have been developed, however, in only a few cases, small and druglike molecules are able to interfere the complex formation of proteins. On the other hand, there a several small molecules known to modulate protein-protein interactions by means of stabilizing an already assembled complex. To achieve this goal, a ligand is binding to a pocket, which is located rim-exposed at the interface of the interacting proteins, e.g. as the phytotoxin Fusicoccin, which stabilizes the interaction of plant H+-ATPase and 14-3-3 protein by nearly a factor of 100. To suggest alternative leads, we performed a virtual screening campaign to discover new molecules putatively stabilizing this complex. Furthermore, we screen a dataset of 198 transient recognition protein-protein complexes for cavities, which are located rim-exposed at their interfaces. We provide evidence for high similarity between such rim-exposed cavities and usual ligand accommodating active sites of enzymes. This analysis suggests that rim-exposed cavities at protein-protein interfaces are druggable targets. Therefore, the principle of stabilizing protein-protein interactions seems to be a promising alternative to the approach of the competitive inhibition of such interactions by small molecules. (3) AffinDB is a database of affinity data for structurally resolved protein-ligand complexes from the PDB. It is freely accessible at http://www.agklebe.de/affinity. Affinity data are collected from the scientific literature, both from primary sources describing the original experimental work of affinity determination and from secondary references which report affinity values determined by others. AffinDB currently contains over 730 affinity entries covering more than 450 different protein-ligand complexes. Besides the affinity value, PDB summary information and additional data are provided, including the experimental conditions of the affinity measurement (if available in the corresponding reference); 2D drawing, SMILES code, and molecular weight of the ligand; links to other databases, and bibliographic information. AffinDB can be queried by PDB code or by any combination of affinity range, temperature and pH-value of the measurement, ligand molecular weight, and publication data (author, journal, year). Search results can be saved as tabular reports in text files. The database is supposed to be a valuable resource for researchers interested in biomolecular recognition and the development of tools for correlating structural data with affinities, as needed, for example, in structure-based drug design

Beschreibung von Proteinbindetaschen für Funktionsstudien und de Novo-Design und die Entwicklung von Methoden zur funktionellen Klassifizierung von Proteinfamilien

Die Analyse der Ähnlichkeitsbeziehungen von Proteinbindetaschen ist das zentrale Thema, das in verschiedenen Variationen in dieser Arbeit bearbeitet wurde.Die grundlegende Annahme hinter dem vorgestellten Ansatz ist, daß die Funktion eines Proteins in starkem Maße von der Gestalt und den physikochemischen Eigenschaften der Bindetasche bestimmt wird. Ähnlichkeiten von Proteinbindetaschen lassen sich demnach dazu nutzen, Rückschlüsse über die Funktion von Proteinen zu erhalten. Außerdem helfen sie in der Identifizierung von Liganden oder Ligandfragmenten, die in verwandte Bindetaschen binden und können so Ideen für das Design von neuen Inhibitoren liefern. Des Weiteren können Ähnlichkeiten in den Bindetaschen nicht Sequenz-verwandter Proteine dazu genutzt werden, mögliche Kreuzreaktivitäten zwischen diesen vorherzusagen. Schließlich bilden sie die Grundlage für eine funktionelle Klassifizierung von Proteinbindetaschen. Die vorgestellte Arbeit baut auf der Methode Cavbase auf, die die geometrische Form und die physikochemischen Eigenschaften von Bindetaschen beschreibt und ähnliche Bereiche in zwei Bindetaschen bestimmt. Die physikochemischen Eigenschaften der Aminosäuren wird durch 3D-Deskriptoren (Pseudozentren) ausgedrückt. Für einige Interaktionseigenschaften der Aminosäuren wurden neue Pseudozentren eingeführt. Ein Vergleich der Bindetaschenrepräsentation mit wissensbasierten Ansätzen wie Superstar und Drugscore hat gezeigt, daß die Eigenschaften der Bindetaschen von Cavbase sehr gut abgebildet werden. Durch die Implementierung der Beschreibung von Bindetaschen durch Bitstrings, konnte die Geschwindigkeit von Bindetaschenvergleichen wesentlich erhöht werden. An verschiedenen Beispielen ist der erfolgreiche Einsatz von Cavbase in der Ähnlichkeitsanalyse und dem Entdecken von verwandten Proteinbindetaschen gezeigt worden. Weiterhin konnten an 26 ausgewählten Proteinen, deren Funktion zum Zeitpunkt der Kristallstrukturbestimmung noch nicht bekannt war (sogenannten hypothetical proteins), die Möglichkeiten und Grenzen des Cavbase Ansatzes gezeigt werden. Cavbase ist in der Lage, funktionelle Ähnlichkeiten mit anderen Proteinen zu entdecken und Ideen für die Funktionsannotierung vorzuschlagen. Ähnlichkeiten in den Bindetaschen von zwei Proteinen können sich in einer unerwünschten Nebenwirkung manifestieren. Eine mögliche Kreuzreaktivität ist bei Sequenz-verwandten Strukturen relativ einfach abzuschätzen. Schwieriger ist die Vorhersage von Kreuzreaktivitäten, wenn die betrachteten Proteine keine Sequenz- und Faltungsmusterhomologie aufweisen. In dieser Arbeit konnte eine im Experiment beobachtete Kreuzreaktivität strukturell verstanden und mit Cavbase nachvollzogen werden . Als zweiten Fall einer möglichen Kreuzreaktivität wurden ähnliche Bereiche in den Bindetaschen von Carboanhydrase und Malatdehydrogenase aufgefunden, die eine im Experiment beobachtbare Kreuzreaktivität strukturell plausibel machen. Traditionelle Methoden, die die Ähnlichkeit zwischen Proteinen oder Proteinbindetaschen bestimmen, vergleichen eine Bindetasche gegen einen großen Datensatz eben solcher und beschränken sich dabei nur auf die Analyse ausgewählter Bindetaschen. In dieser Arbeit wurde der Fokus stattdessen auf eine Clusteranalyse von großen Datensätzen gelegt. Dabei steht jetzt nicht die Ähnlichkeitsbeziehungen einzelner Bindetaschen zueinander im Vordergrund, sondern die gleichzeitige Analyse von Ähnlichkeitsbeziehungen von mehreren Bindetaschen. In dieser Arbeit wurden deshalb Methoden entwickelt, um große Datensätzen von Bindetaschen miteinander vergleichen und Ähnlichkeits- und Clusteranalysen durchführen zu können. Durch den Einsatz heuristischer Filter konnten Bindetaschenvergleichen wesentlich beschleunigt werden. Besonders interessant ist die Analyse von Proteinfamilien. Am Beispiel von zwei pharmazeutisch relevanten Proteinfamilien den alpha-Carboanhydrasen und den Proteinkinasen konnte gezeigt werden, wie sich Ähnlichkeiten und Unterschiede in den Bindetaschen dazu nutzen lassen, um eine funktionelle Klassifizierung dieser Familien aufzubauen. Cavbase ist in der Lage, die betrachteten Bindetaschen auf der Ebene der Proteinsubfamilie zu unterscheiden

Novel Strategies for Model-Building of G Protein-Coupled Receptors

The G protein-coupled receptors constitute still the most densely populated proteinfamily encompassing numerous disease-relevant drug targets. Consequently, medicinal chemistry is expected to pursue targets from that protein family in that hits need to be generated and subsequently optimized towards viable clinical candidates for a variety of therapeutic areas. For the purpose of rationalizing structure-activity relationships within such optimization programs, structural information derived from the ligand's as well as the macromolecule's perspective is essential. While it is relatively straightforward to define pharmacophore hypotheses based on comparative modelling of structurally and biologically characterized low-molecular weight ligands, a deeper understanding of the molecular recognition event underlying, remains challenging, since the principally available amount of experimentally derived structural data on GPCRs is extremely scarse when compared to, e.g., soluble enzymes. In this context, the protein modelling methodologies introduced, developed, optimized, and applied in this thesis provide structural models that are capable of assisting in the development of structural hypotheses on ligand-receptor complexes. As such they provide a valuable structural framework not only for a more detailed insight into ligand-GPCR interaction, but also for guiding the design process towards next-generation compounds which should display enhanced affinity. The model building procedure developed in this thesis systematically follows a hierarchical approach, sequentially generating a 1D topology, followed by a 2D topology that is finally converted into a 3D topology. The determination of a 1D topology is based on a compartmentalization of the linear amino acid sequence of a GPCR of interest into the extracellular, intracellular, and transmembrane sequence stretches. The entire chapter 3 of this study elaborates on the strengths and weaknesses of applying automated prediction tools for the purpose of identifying the transmembrane sequence domains. Based on an once derived 1D topology, a type of in-plane projection structure for the seven transmembrane helices can be derived with the aide of calculated vectorial property moments, yielding the 2D topology. Thorough bioinformatics studies revealed that only a consensus approach based on a conceptual combination of different methods employing a carefully made selection of parameter sets gave reliable results, emphasizing the danger to fully automate a GPCR modelling procedure. Chapter 4 describes a procedure to further expand the 2D topological findings into 3D space, exemplified on the human CCK-B receptor protein. This particular GPCR was chosen as the receptor of interest, since an enormous experimentally derived and structurally relevant data-set was available. Within the computational refinement procedure of constructed GPCR models, major emphasis was laid on the explicit treatment of a non-isotropic solvent environment during molecular mechanics (i.e. energy minimization and molecular dynamics simulations) calculations. The majority of simulations was therefore carried out in a tri-phasic solvent box accounting for a central lipid environment, flanked by two aqueous compartments, mimicking the extracellular and cytoplasmic space. Chapter 5 introduces the reference compound set, comprising low-molecular weight compounds modulating CCK receptors, that was used for validation purposes of the generated models of the receptor protein. Chapter 6 describes how the generated model of the CCK-B receptor was subjected to intensive docking studies employing compound series introduced in chapter 5. It turned out that by applying the DRAGHOME methodology viable structural hypotheses on putative receptor-ligand complexes could be generated. Based on the methodology pursued in this thesis a detailed model of the receptor binding site could be devised that accounts for known structure-activity relationships as well as for results obtained by site-directed mutagenesis studies in a qualitative manner. The overall study presented in this thesis is primarily aimed to deliver a feasibility study on generating model structures of GPCRs by a conceptual combination of tailor-made bioinformatics techniques with the toolbox of protein modelling, exemplified on the human CCK-B receptor. The generated structures should be envisioned as models only, not necessarily providing a detailed image of reality. However, consistent models, when verified and refined against experimental data, deliver an extremely useful structural contextual platform on which different scientific disciplines such as medicinal chemistry, molecular biology, and biophysics can effectively communicate

Erkennen von Proteinoberflächen durch ungewöhnliche Substrat-analoge Inhibitoren am Beispiel der cAMP-abhängigen Proteinkinase A

Im Rahmen dieser Arbeit sollten innerhalb eines Kooperationsprojektes mit den Arbeitsgruppen GEYER und DEHNEN aus Marburg und SCHREINER aus Gießen, nach Maßgabe des LOEWE-SynChemBio-Projektes, mehrere Konzepte zur Entwicklung neuer selektiver peptidischer Inhibitoren für Proteinkinasen entwickelt und mithilfe von Bindungsassays, Proteinkristallisation und Röntgenstrukturanalyse verifiziert werden. Im Rahmen dieses Projektes sollte versucht werden, Ribo-Aminosäuren innerhalb des peptidischen Liganden PKI einzuführen, um einen Ansatzpunkt für Reaktionen mit Boronsäuren zu erhalten. Anschließend sollten Derivate des literaturbekannten, hochaffinen Inhibitors Fasudil, der innerhalb der ATP-Bindetasche von Kinasen bindet, mit einer Phenylboronsäure-Gruppe synthetisiert werden. Die in Folge der Bindung der Fasudil-Derivate an die PKA in Richtung der Peptid-Bindetasche ausgerichtete Phenylboronsäure sollte analog wie in DMSO NMR-spektroskopisch durch Dr. ROMINA KIRSCHNER nachgewiesen, in Lösung mit der Ribose des peptidischen Liganden reagieren und somit beide Bindestellen verknüpfen

The Power of Fragments: FBLD approach to investigate protein structures

Fragments are small chemical entities with the extraordinary advantage of belonging to a wide variety of functional groups able to explore various chemical spaces, penetrate small protein pockets and allow the mapping of various protein binding sites. Nowadays, fragment-based lead discovery (FBLD) is the method of choice to screen fragment libraries and plays an increasingly important role in the drug development process. It becomes therefore particularly important to have a general-purpose fragment library ready to use. In our group a 96-fragment library was validated on eight protein targets, which was designed in a joint project between the HZB MX-group at BESSY II (AG Weiss) and the Institute of Pharmaceutical Chemistry, University of Marburg (AG Klebe) (Part I). Among the eight validated proteins, there are Thermolysin (TLN, Part II) and Trypanosoma cruzi Farnesyl Pyrophosphate Synthase (T. cruzi FPPS, Part III) which were the main focus of the present study. The 96-fragment library was therefore used as primary X-ray crystallographic screening method to search for novel chemical scaffolds. However, a new soaking protocol had to be established prior to the fragment screening. In fact, unlike the typical TLN inhibitor, fragments usually have insufficient affinity to displace on their own the autoproteolitically product Val-Lys dipeptide which occupies the TLN active site. The protein crystals were therefore incubated in an isopropanol solution able to displace the dipeptide and subsequentially screened against the fragment library resulting in seven crystallographic fragment hits. Unlike TLN which is usually used as a model protein, T. cruzi FPPS is a key enzyme involved in the mevalonate pathway and is essential for sterol production. T. cruzi and T. brucei parasites cause Chagas disease (CD) and human African trypanosomiasis (HAT) respectively and inhibition of FPPS in these species is therefore a valid target to fight these two tropical diseases. The present work focused first on optimizing the stability of protein samples in solution using various techniques such as thermal shift assay (TSA) and light scattering (LS). A crystallization and soaking protocol were subsequently established prior to performing a crystallographic fragment screening of the above-mentioned 96 fragment library. In addition, the role of the magnesium ion as cofactor of the enzyme was also elucidated, either alone or in complex with isopentenyl pyrophosphate (IPP) or bisphosphonates (BPs). Based on the discovery by Jahnke et al. of a new allosteric pocket in human FPPS, it was assumed that a similar pocket was also present in the Trypanosoma species which was therefore the main target-site of the present work. The fragment screening project resulted in three crystallographic hits, one of which binding the allosteric pocket while the other two in a new pocket whose function is still unknown. They can serve as good candidates for the design of a new series of lead compounds. In addition to the 96-fragment library, other series of compounds of fragment-size were screened against Endothiapepsin (EP, Part IV) and different human Carbonic Anhydrase (hCA, Part V) isoforms. In particular, a series of tetrazole compounds were crystallographically screened against EP in order to validate a novel pipeline for the rapid development of novel aspartyl protease inhibitors using an anchoring approach. The hydrazide moiety was here chosen as fragment-anchor able to bind the catalytic dyad in the EP active site. Moreover, in addition to X-ray crystallography which was the dominant screening method used in the present thesis, a series of para-substituted benzenesulfonamide were screened against different hCAs isoforms using Surface Plasmon Resonance (SPR). According to Gaspari et al., the kinetics of binding of hCAII depend on the nature of the substituent that decorate the benzenesulfonamide moiety. In particular, the association rate kon becames faster by increasing the hydrophobic nature of the para-alkyl chain due to a pre-binding event. This finding was also confirmed in the present study. However, it seems that more than one features contribute to the trends in kon and koff. Furthermore, in contrast with hCAII, hCAXII showed a faster dissociation rate by increasing the length of the para-alkyl chain, probably due to the higher surface hydrophilicity. The nature of the surface around the active site of hCAs plays therefore an important role in the kinetics of binding. In conclusion, fragments are powerful molecules able to explore and discover new protein pockets, to evolve into more potent lead compounds and often they are used as starting point in several screening methods in the field of FBLD

Development of models to describe the dynamics and interaction with water molecules in protein-ligand binding

Wassermoleküle formen Netzwerke, die einen erheblichen Einfluss auf die Protein-Ligand Bingung nehmen. Sowohl strukturelle als auch thermodynamische Daten werden miteinander korreliert. Durch Molekulardynamische Simulationen werden Netzwerke erfolgreich reproduziert und vorhergesagt

Optimiertes Design kombinatorischer Verbindungsbibliotheken durch Genetische Algorithmen und deren Bewertung anhand wissensbasierter Protein-Ligand Bindungsprofile

In dieser Arbeit sind die zwei neuen Computer-Methoden DrugScore Fingerprint (DrugScoreFP) und GARLig in ihrer Theorie und Funktionsweise vorgestellt und validiert worden. DrugScoreFP ist ein neuartiger Ansatz zur Bewertung von computergenerierten Bindemodi potentieller Liganden für eine bestimmte Zielstruktur. Das Programm basiert auf der etablierten Bewertungsfunktion DrugScoreCSD und unterscheidet sich darin, dass anhand bereits bekannter Kristallstrukturen für den zu untersuchenden Rezeptor ein Referenzvektor generiert wird, der zu jedem Bindetaschenatom Potentialwerte für alle möglichen Interaktionen enthält. Für jeden neuen, computergenerierten Bindungsmodus eines Liganden lässt sich ein entsprechender Vektor generieren. Dessen Distanz zum Referenzvektor ist ein Maß dafür, wie ähnlich generierte Bindungsmodi zu bereits bekannten sind. Eine experimentelle Validierung der durch DrugScoreFP als ähnlich vorhergesagten Liganden ergab für die in unserem Arbeitskreis untersuchten Proteinstrukturen Trypsin, Thermolysin und tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) sechs Inhibitoren fragmentärer Größe und eine Thermolysin Kristallstruktur in Komplex mit einem der gefundenen Fragmente. Das in dieser Arbeit entwickelte Programm GARLig ist eine auf einem Genetischen Algorithmus basierende Methode, um chemische Seitenkettenmodifikationen niedermolekularer Verbindungen hinsichtlich eines untersuchten Rezeptors effizient durchzuführen. Zielsetzung ist hier die Zusammenstellung einer Verbindungsbibliothek, welche eine benutzerdefiniert große Untermenge aller möglichen chemischen Modifikationen Ligand-ähnlicher Grundgerüste darstellt. Als zentrales Qualitätskriterium einzelner Vertreter der Verbindungsbibliothek dienen durch Docking erzeugte Ligand-Geometrien und deren Bewertungen durch Protein-Ligand-Bewertungsfunktionen. In mehreren Validierungsszenarien an den Proteinen Trypsin, Thrombin, Faktor Xa, Plasmin und Cathepsin D konnte gezeigt werden, dass eine effiziente Zusammenstellung Rezeptor-spezifischer Substrat- oder Ligand-Bibliotheken lediglich eine Durchsuchung von weniger als 8% der vorgegebenen Suchräume erfordert und GARLig dennoch im Stande ist, bekannte Inhibitoren in der Zielbibliothek anzureichern

17β Hydroxysteroid Dehydrogenase 14 (17β-HSD14): Entwicklung und Synthese potenter und selektiver Inhibitoren zur strukturellen Charakterisierung und Untersuchung der physiologischen Rolle des Enzyms

In dieser Arbeit wird die Familie der 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenasen (17β-HSDs) vorgestellt, die in vitro die Oxidation und/oder Reduktion von Steroidhormonen in Position 17 des Steroidgerüstes katalysieren. 17β-HSDs besitzen die Fähigkeit lokale Konzentrationen von aktiven und inaktiven Hormonderivaten in bestimmten Gewebearten nach dem intrakrinen Konzept regulieren zu können.1 Demnach können sie als molekulare Schalter betrachtet werden, die als Prärezeptorregulatoren auf die Funktion von Steroidhormonen wirken, bevor sie an die entsprechenden Rezeptoren angreifen.2,3 Die Blockade dieser Enzyme durch potente und selektive Inhibitoren kann daher ein vielversprechender therapeutischer Ansatz zur Behandlung von steroidhormonabhängigen Erkrankungen sein. So konnten Inhibitoren für die 17β-HSDs 1, 2 und 3 entwickelt werden, mit denen nach der in vivo Verabreichung ein „proof of concept“ für die Behandlung von Brustkrebs, Osteoporose und Prostatakrebs erbracht wurde.4–10 Vor allem für die Subtypen 4-14 wurde weiterhin eine weitaus ausgeprägtere Multifunktionalität beschrieben, sodass diese ebenfalls andere Substrate als Steroidhormone zulassen.11–13 17β-HSD14 ist das zuletzt identifizierte Mitglied dieser Enzymfamilie, das überwiegend im Gehirn, Leber, Plazenta und den Nieren exprimiert wird.14,15 Durch die oxidative Deaktivierung von E2 durch das Enzym wurde ihm eine steroidogene Funktion zugeschrieben, für das JANSSON et al. erste Argumente erbrachten.16 Der langsame katalytische Umsatz (kcat-Wert) von E2 lässt diese Annahme jedoch fraglich erscheinen.15 Da die physiologische Rolle des Enzyms nicht vollständig aufgeklärt und die Frage nach dem natürlichen Substrat nicht zweifelsfrei beantwortet ist, war es das Ziel dieser Arbeit potente und selektive Inhibitoren der 17β-HSD14 zu entwickeln. Diese sollten eine ergänzende strukturelle Charakterisierung des Enzyms ermöglichen und ferner zu tool compounds weiterentwickelt werden, um die physiologische Rolle des Enzyms untersuchen zu können

The well-tempered Thrombin - A systematic crystallographic and calorimetric study on the thermodynamics of serine-protease inhibition

The presented study contributes to the fundamental understanding of molecular recognition of small molecules by a macromolecular host protein. The biophysical properties of a large set of systematically varied thrombin inhibitors were anatomized in detail. In particular the combination of structural information from X-ray crystallography with thermodynamic data from microcalorimetry allowed following the thermodynamically relevant differences resulting in the binding process. The approach of systematically varying biophysical properties of protein inhibitors in small steps permits conclusive statements on the contribution of individual functionalities to binding affinity, as the outstanding complexity of the binding thermodynamics could be reduced to the comparison of closely related inhibitors. Reorganization of solute molecules was explicitly considered in all discussions of the factors determining the widely varying binding affinity of the inhibitors to their target